然而，太醫院的工作，并非李時珍生平所愿，他感到終日為皇室服役，有悖于濟世救人的志向。于是在任職一年后，便托病辭歸故鄉。在長期醫療實踐中，李時珍發現以往本草書中有不少錯訛，而且在某些用藥經驗方面也已不適應當時的需要，于是立下了重修本草的宏愿。他研讀了大量的醫藥專書，并博覽凡與藥物有關的資料。李時珍并不滿足從書本所得的知識，在多年寒窗苦讀之后，就藥物研究的問題，廣泛地向農夫、漁民、獵戶、樵夫，以及眾多民間醫生請教，并躬親實踐，深入實地作種種必要的考察。如為了掌握蘄蛇的第一手資料，他冒著生命危險，幾次攀登龍峰山，直到實地看清了蘄蛇特征，并作了真實記錄為止。

在研究考察藥物過程中，他糾正了舊本草存在的許多謬誤。他對待醫藥研究，始終以科學實踐為依據而不迷信邪說。如“水銀”這味藥，《神農本草經》說能久服成仙，葛洪《抱樸子》也說是長生之藥，而他則力辟其謬，認為水銀是劇毒的藥物，歷代很多文人、達官因為相信術士的宣傳而服之而死，認為本草書籍不應當妄加記載。由于李時珍具有這種嚴謹的科學態度和實事求是的精神，所以才使《本草綱目》能夠成為對世界藥物學發展產生深遠影響的一部巨著。

為了完成這部藥物學巨著，李時珍傾注了畢生的精力和心血，其足跡幾乎踏遍了湖北、湖南、江西、安徽、江蘇、河南、河北、山東、福建、廣東等地的山山水水，并參考了總越千家的古籍文獻。在將近30年的時間里，前后三易其稿，可謂艱苦備嘗。此后待到《本草綱目》最終編定完稿，他已從生氣勃勃的青年，變成一個60開外，精力耗盡，頭鬢斑白的老者了。《本草綱目》系統而又全面地總結了我國明代以前的藥物學成就。全書近200萬字，將所收1892種藥物（其中374種是李時珍發現而新增的）劃歸16部、60類分述。書中附方達10000余首，插圖1000多幅。每種藥物之下，依次分為釋名、集解、正誤、修治、氣味、主治、發明、附方等項，可謂條分屢析，內容賅備。

《本草綱目》的巨大成就，不僅表現在藥物學方面，而且還旁及天文、地質、化學、植物學等方面，堪稱我國古代百科全書。該書問世后，學者無不嘆為觀止，備加稱賞。自16世紀在金陵刊行后，陸續翻刻的中文版本不下60版，而且還不包括以《本草綱目》為藍本而加以節選、改編、闡釋、補訂的各種續編或簡編本。不僅如此，《本草綱目》還先后有了日、朝、德、法、英、俄、拉丁等文字的譯本，產生了極為廣泛的國際影響。醫圣李時珍的名字，不僅在我國醫藥史上閃耀著熠熠光輝，而且還不容置疑地載入了世界科學偉人的名錄。